Szakdolgozati lehetőségek

TDK és MSc. témák

  1. A Protein kináz D (PKD) szerepének vizsgálata oxidativ stresszel előidézett neurodegeneráció során. A PKD-t az idegsejtek pusztulását/túlélését befolyásoló számos szignálútvonal is aktiválja. A legújabb kutatások alapján a PKD aktivitás fokozódása oxidatív stressz alatt protektív szerepet tölt be, míg idegsejtekben a PKD aktivitás gátlása a Golgi komplex fragmentálódását és a dendritfa zsugorodását okozza és fokozott idegsejtpusztuláshoz vezet. A szakdolgozati/TDK munka elsősorban annak felderítésére irányul, hogy a PKD aktivitás változása az idegsejtek túlélését, élettartamát és különböző stressz-faktorokkal szembeni ellenállását hogyan befolyásolja. A kísérletek során az idegsejtek PKD aktivitását mind normál, mind az idegsejtek pusztulását előidéző oxidatív stressz mellett vizsgáljuk. Az endogén PKD aktivitást genetikai vagy farmakológiai beavatkozásokkal módosítjuk, majd életképességi tesztekkel, fehérje szinten és mikroszkópos analízisek segítségével elemezzük, hogy a módosított PKD aktivitás az idegsejtek túlélését vagy pusztulását mennyire befolyásolja.
  2. A protein kináz D (PKD) intracelluláris eloszlásának és aktivitásának vizsgálata idegsejtekben: az axonális jelenléthez szükséges funkcionális és struktúrális sajátságok azonosítása. Korábbi, hippokampális idegsejtekben elvégzett kísérleteink alapján tudjuk, hogy a PKD aktivitás megléte elengedhetetlen az enzim axonális jelenlétéhez. Deléciókat vagy pontmutációkat tartalmazó, fluoreszcensen jelzett PKD konstrukciók transzfektálásával és az intracelluláris eloszlás kvantitatív mikroszkópiás elemzésével végezzük az axonális jelenléthez szükséges funkcionális és struktúrális PKD sajátságok azonosítását. Az axonális transzportfolyamatok dinamikájának elemzéséhez gyors live cell imaging technika segítségével a különböző PKD mutáns konstrukciók axonális transzportját közvetlenül, kvantitatívan is elemezni tudjuk. Elemezzük a PKD és az axonális transzportfolyamatokban szerepet játszó motor és adaptor fehérjék közötti közvetlen vagy közvetett kapcsolatokat is. A kísérletekhez szükséges live cell imaging méréseket németországi együttműködő partnerünk laboratóriumában végezzük.
  3. A protein kináz D szerepének vizsgálata a dendritfa fenntartása során. Korábbi vizsgálataink során megmutattuk, hogy a PKD aktivitás gátlása a dendritfa zsugorodásához, aktivitásának fokozódása pedig a nyúlványrendszer kiterjedtségének növeléséhez vezet. Előzetes eredményeink szerint a PKD aktivitás emellett a dendrittüskék morfológiájára, sűrűségére és motilitására is hatással van. Kutatómunkánk során ezeknek a folyamatoknak a molekuláris hátterét szeretnénk feltárni, elsősorban a RIN1 (Ras/Rab interaktor fehérje 1) PKD-függő foszforilációjának vizsgálatával. A tervezett vizsgálatok a klasszikus és modern molekuláris biológiai technikák mellett igen sokrétű mikroszkópos elemzéseket is magukba foglalnak.

 

PhD témák, lehetőségek

  1. A protein kináz D neuroprotektív szerepének vizsgálata az idegsejtek pusztulását előidéző hatások alatt.

A neurodegeneráció során az idegsejtek pusztulását a túlfokozott apoptózis vagy autofágia, illetve nekrózis-szerű sejtpusztulás okozhatja. Mind a neurodegeneratív betegségek, mint pl. az Alzheimer, Parkinson vagy Huntington kór esetén, mind a traumás agysérülések következtében a kórokok hátterében igen jelentős neuronpusztulás áll. Éppen ezért az idegsejtek pusztulását kivédő, újszerű és hatásos genetikai vagy farmakológiai kezelések felfedezése és alkalmazása kiemelkedő gyógyászati, társadalmi és gazdasági jelentőségű.

Protein kináz D (PKD) a Ser/Thr kinázok egy újonnan elkülönített csoportja. Emlősökben 3 izoformája van (PKD1-3), melyek részben átfedő és igen szerteágazó funkcióval bírnak. A PKD sejten belüli szerepének felderítésére az utóbbi 10 évben igen intenzív kutatás irányul, így a sejtosztódás és -növekedés, a differenciációs folyamatok, a sejtvándorlás és áttét-képződés, az intracelluláris irányított fehérjetranszport vagy az oxidatív stressz okozta sejtpusztulás során is sikerült már a PKD jelentőségét bizonyítani (összefoglalóként ld. [1-6]). Az általánosan elfogadott nézet szerint a PKD azért képes ennyire szerteágazó és sejttípus-függő hatás kialakítására, mert aktiválódását több jelátviteli útvonal is befolyásolja. A PKD aktiválódásához mind az upstream kinázok által végzett foszforilációra, mind a membránokban képződő diacilglicerolhoz való kötődésre is szükség van. Ezt követően az aktivált PKD molekula a plazma- és intracelluláris membránokhoz kapcsolódva, a citoplazmában vagy a sejtmagban is kifejtheti hatását.

Annak ellenére, hogy a PKD izoformák a központi idegrendszerben már igen korán és nagy mennyiségben kifejeződnek [7, 8], a PKD idegsejtekben betöltött szerepét csak az utóbbi években kezdték el vizsgálni. Az eddigi közlemények elsősorban a transzportfolyamatokra és a dendritfejlődésre kifejtett hatását vizsgálták [9-12], de egyre több jel mutat arra, hogy a PKD az idegsejtek túlélését is szabályozza.

A PKD gén teljes deléciója egerekben embrionálisan letális [13]. Az ELTE Élettani és Neurobiológiai Tanszék Idegi Sejtbiológiai Laboratóriumában elvégzett kutatások alapján egyértelmű, hogy a PKD hatás a már differenciálódott idegsejtekben történő gátlása az idegsejtek degenerációját okozza [9]. A PKD domináns-negatív hatású, mutáns formájának (kdPKD) egér embrionális hippokampális idegsejtekben való termeltetése a dendritfa zsugorodásához, a neuronális Golgi apparátus fragmentálódásához és intracelluláris fehérje-aggregátumok kialakulásához, majd sejtpusztuláshoz vezetett. Hasonló változásokat a kdPKD molekulát idegsejt-specifikusan és indukálható módon termelő transzgenikus egerek agyszövetében is megfigyeltek. A PKD aktivitás növelése ezzel szemben a neuronális Golgi morfológiát vagy az idegsejtek normál körülmények melletti túlélését nem befolyásolta, sőt a transzfektált idegsejtek dendritfájának kiterjedését okozta. A Golgi apparátus fragmentációja és az intracelluláris fehérje-aggregátumok megjelenése a neurodegeneratív betegségek (pl. amiotrófiás laterális szklerózis, Alzheimer vagy Creuzfeldt-Jacob kór, spinocerebelláris ataxia) vagy oxidatív stressz során igen gyakori tünet [14-16]. Mindezek azt jelzik, hogy a PKD aktivitás gátlása a neurodegenerációs, míg aktivitásának fokozása a neuroprotektív hatások kialakulását segítheti.

 

A doktori munka célkitűzései

Egér agyszövetben és idegsejttenyészetekben kívánjuk felderíteni, hogy az idegsejtek pusztulását kiváltó beavatkozások (oxidatív stressz, hipoxia/ischemia, excitatórikus sérülés, ATP elvonás) során mikor és milyen mértékben mutatható ki a PKD neuroprotektív hatása. Vizsgálatainkban a PKD aktivitást genetikai és farmakológiai eszközökkel is befolyásoljuk, majd elemezzük, hogy i) a megnövelt PKD aktivitás fokozza-e az idegsejtek túlélését, illetve ii) a PKD aktivitás gátlása súlyosbítja-e a neurodegeneratív folyamatokat. A PKD által irányított, túlélést befolyásoló folyamatok mechanizmusára is adatokat kívánunk nyerni.

 

Elsajátítható technikák

  • Sejt- és szövettenyészési ismeretek: különféle sejtvonalak fenntartása; immortalizált neuroektodermális őssejtek idegsejt-irányú differenciáltatása; embrionális vagy újszülött egér vagy patkány agyból idegszövet-tenyészetek készítése
  • DNS, RNS technikák: genomiális és plazmid DNS, valamint totál RNS és mRNS izolálás tenyészetekből vagy állati szövetekből; PCR; RT-PCR; real time PCR
  • Génbejuttatás idegsejtekbe: (ko)transzfekció plazmidokkal; a termeltetett fehérjék intracelluláris eloszlásának és transzportjának vizsgálata; géncsendesítés RNAi technikával
  • Fehérje kimutatások: SDS-PAGE + Western blot; immuncitokémiai és immunhisztokémiai detektálások, immunprecipitáció, pull-down, stb
  • Mikroszkópos technikák: fény-, fluoreszcens és konfokális mikroszkópok használata; fehérje-kölcsönhatások (FRET) és intracelluláris transzportfolyamatok (FRAP) vizsgálata; time lapse videomikroszkópiás megfigyelések; gyors fluoreszcens live cell imaging németországi együttműködő partnereink mikroszkópos laboratóriumában (Zeiss CellObserver és Zeiss LSM710 konfokális mikroszkópokkal); anatómiai, hisztológiai elemzések; képanalizáló eljárások
  • Életképességi, toxicitási tesztek alkalmazása sejt- és szövettenyészetekben; intracelluláris Ca2+ szint változások követése (Ca image); mitokondriális membránpotenciál-változások követése fluorimetrás vizsgálatokkal (FACS)

Hivatkozások

  1. Bard, F. & Malhotra, V. (2006) The formation of TGN-to-plasma-membrane transport carriers. Annu Rev Cell Dev Biol 22, 439-55.
  2. Avkiran, M., Rowland, A. J., Cuello, F. & Haworth, R. S. (2008) Protein kinase d in the cardiovascular system: emerging roles in health and disease. Circ Res 102, 157-63.
  3. Rykx, A., De Kimpe, L., Mikhalap, S., Vantus, T., Seufferlein, T., Vandenheede, J. R. & Van Lint, J. (2003) Protein kinase D: a family affair. FEBS Lett 546, 81-6.
  4. Van Lint, J., Rykx, A., Maeda, Y., Vantus, T., Sturany, S., Malhotra, V., Vandenheede, J. R. & Seufferlein, T. (2002) Protein kinase D: an intracellular traffic regulator on the move. Trends Cell Biol 12, 193-200.
  5. Wang, Q. J. (2006) PKD at the crossroads of DAG and PKC signaling. Trends Pharmacol Sci 27, 317-23.
  6. Storz, P. (2007) Mitochondrial ROS--radical detoxification, mediated by protein kinase D. Trends Cell Biol 17, 13-8.
  7. Ellwanger, K., Pfizenmaier, K., Lutz, S. & Hausser, A. (2008) Expression patterns of protein kinase D 3 during mouse development. BMC Dev Biol 8, 47.
  8. Oster, H., Abraham, D. & Leitges, M. (2006) Expression of the protein kinase D (PKD) family during mouse embryogenesis. Gene Expr Patterns 6, 400-8.
  9. Czondor, K., Ellwanger, K., Fuchs, Y. F., Lutz, S., Gulyas, M., Mansuy, I. M., Hausser, A., Pfizenmaier, K. & Schlett, K. (2009) Protein kinase d controls the integrity of Golgi apparatus and the maintenance of dendritic arborization in hippocampal neurons. Mol Biol Cell 20, 2108-20.
  10. Bisbal, M., Conde, C., Donoso, M., Bollati, F., Sesma, J., Quiroga, S., Diaz Anel, A., Malhotra, V., Marzolo, M. P. & Caceres, A. (2008) Protein Kinase D Regulates Trafficking of Dendritic Membrane Proteins in Developing Neurons. J Neurosci 28, 9297-9308.
  11. Horton, A. C., Racz, B., Monson, E. E., Lin, A. L., Weinberg, R. J. & Ehlers, M. D. (2005) Polarized secretory trafficking directs cargo for asymmetric dendrite growth and morphogenesis. Neuron 48, 757-71.
  12. Yin, D. M., Huang, Y. H., Zhu, Y. B. & Wang, Y. (2008) Both the establishment and maintenance of neuronal polarity require the activity of protein kinase D in the Golgi apparatus. J Neurosci 28, 8832-43.
  13. Fielitz, J., Kim, M. S., Shelton, J. M., Qi, X., Hill, J. A., Richardson, J. A., Bassel-Duby, R. & Olson, E. N. (2008) Requirement of protein kinase D1 for pathological cardiac remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 3059-63.
  14. Gonatas, N. K., Stieber, A. & Gonatas, J. O. (2006) Fragmentation of the Golgi apparatus in neurodegenerative diseases and cell death. J Neurol Sci 246, 21-30.
  15. Nakagomi, S., Barsoum, M. J., Bossy-Wetzel, E., Sutterlin, C., Malhotra, V. & Lipton, S. A. (2008) A Golgi fragmentation pathway in neurodegeneration. Neurobiol Dis 29, 221-31.
  16. Fan, J., Hu, Z., Zeng, L., Lu, W., Tang, X., Zhang, J. & Li, T. (2008) Golgi apparatus and neurodegenerative diseases. Int J Dev Neurosci 26, 523-34.